Analiza ilościowa białek.
Analiza ilościowa białek jest ważna w wielu branżach i zastosowaniach. Do białek należy różnorodna grupa związków, które uczestniczą w praktycznie każdym biologicznym procesie. Białka to substancje budulcowe, hormony, cząsteczki transportujące, receptory komórkowe, czynniki wzrostu i różnicowania komórek. Ze względu na to, analiza oddziaływań pomiędzy białkami jest kluczowa w projektowaniu i produkcji leków.
Białka są makrocząsteczkami – podstawą ich struktury stanowią łańcuchy polipeptydowe zawierające od 100 do ponad 10000 aminokwasów (10 – 100 kDa). Proteiny występują w formach prostych i złożonych. Białka złożone zawierają w swojej strukturze składnik niebiałkowy (cukier, lipidy, jony metalu lub barwniki).
W naszym laboratorium analizy proteomiczne, w tym analiza ilościowa białek, wykonujemy metodami HPLC-MS lub HPLC-MS/MS na spektrometrze mas wysokiej rozdzielczości ZenoTOF 7600 (SCIEX). Uzyskane wyniki opracowujemy za pomocą oprogramowania Sciex OS, Spectronaut, Skyline.
MS vs MS/MS
Analiza ilościowa białka intact (całego białka w formie nienaruszonej) prowadzi do podania stężenia (określonego na podstawie przygotowanej krzywej ze wzorca (z matrycą lub bez)) oraz potwierdzenia identyfikacji za pomocą nałożenia (na zasadzie odzwierciedlenia) oznaczonego w próbie widma MS białka do MS widma wzorca. Na potrzeby klienta możemy wygenerować listę związków o strukturze białkowej (zanieczyszczeń), które zidentyfikowano w badanej próbie oraz określić stosunek ich powierzchni sygnału do powierzchni sygnału analizowanego białka.
Wynik proteomicznej analizy ilościowej peptydów pozwala na precyzyjne i dużo bardziej czułe wyznaczenie stężenia białka. Analiza opiera się na danych MS/MS uzyskanych dla peptydów uzyskanych wyniku trawienia z użyciem enzymów proteolitycznych. Na raportowany wynik składa się stężenie badanego białka i potwierdzenie jego obecności na podstawie oznaczonej sekwencji aminokwasów. W przypadku takich analiz zalecane jest dodanie standardów wewnętrznych.
Nasza oferta:
- W przypadku białek i peptydów o małych masach – analiza intact z detekcją MS;
- Białka o masach >20kDa wymagają optymalizacji metody trawienia i detekcji MS/MS. W efekcie uzyskuje się specyficzne sygnały pochodzące z analizowanego białka w mieszaninie/matrycy;
- Ze złożonych matryc (m.in. surowica, hodowla komórek, zawiesina grzybów) analiza próby składa się z kilku etapów:
- Oczyszczanie próby;
- Trawienie w celu uzyskania unikalnych peptydów, umożliwiających odróżnienie analizowanych białek od innych zawartych w próbie protein;
- Przygotowanie próby wymaga odpowiedniej optymalizacji metody oraz walidacji (kryteria walidacji ustalmy indywidualnie);
- Raportowany wynik ilościowy zawiera potwierdzenie obecności białka w formie natywnej bądź pochodzącego z niego peptydu (zazwyczaj potwierdzenie obejmuje min. dwie sekwencje peptydowe);
- Analiza statystyczna za pomocą narzędzi: MarkerView (PCA), GraphPad Prism, Trendy, Sciex OS.
Do optymalizacji i walidacji metody niezbędnym jest dostarczenie wzorca, w przypadku białek o dużych masach – polecane jest dodanie standardu wewnętrznego.
Zobacz także:
